Головна

Акушерство   Анатомія   Анестезіологія   Вакцинопрофілактика   Валеологія   Ветеринарія   Гігієна   Захворювання   Імунологія   Кардіологія   Неврологія   Нефрологія   Онкологія   Оториноларингологія   Офтальмологія   Паразитології   Педіатрія   Перша допомога   Психіатрія   Пульмонологія   Реанімація   Ревматологія   Стоматологія   Терапія   Токсикологія   Травматологія   Урологія   Фармакологія   Фармацевтика   Фізіотерапія   Фтизіатрія   Хірургія   Ендокринологія   Епідеміологія  

Короткі теоретичні відомості. Реакція нейтралізації широко використовується у вірусологічний практиці

Реакція нейтрализациишироко використовується у вірусологічний практиці. Вона призначена для ідентифікації виділеного вірусу, визначення наявності антитіл і зміни їх титру в сироватці крові хворих і тваринах, що перехворіли, встановлення кількісного вмісту антитіл в лікувальних, профілактичних і діагностичних препаратах (гамма-глобулини, діагностичні сироватки).

Суть реакції нейтрализациизаключается в здатності вируснейтрализующих антитіл імунних сироваток придушувати інфекційні властивості вірусу. Внаслідок цього вірус втрачає здатність розмножуватися і викликати зміни, що піддаються обліку в чутливій до нього біологічній системі (культура кліток, развирающийся курячий ембріон, організм сприйнятливої лабораторної тварини).

Достоинствамиреакції нейтралізація є її універсальність і висока специфічність. До недостаткамотносятся: висока трудомісткість, необхідність суворого дотримання стерильності матеріалів і інструментів, висока вартість тесту-об'єктів, необхідність проведення математичних розрахунків, відносна тривалість при постановці реакції. На результати РН, особливо на їх достоверностьи воспроизводимость, впливають ряд чинників: методика постановки реакції, спосіб і правильність її обліку, концентрація сироваток, що використовуються і вірусів, метод розведення компонентів реакції і інш. Вируснейтрализующие антитіла нагромаджуються в організмі в період видужання (реконвалесценції) і залишаються в ньому тривалий час. Оптимальні терміни для виявлення антитіл в кожному випадку різні і залежать від особливостей імунітету при тій або інакшій інфекції. Наприклад, при грипі свинь максимальний титр вируснейтрализующих антитіл реєструється між 14 і 27-м днями і знижується до 6 місяців. При лейкозі птахів антитіла виявляються через 4 тижні після зараження і зберігаються протягом всього життя.

Сироватки, вживані в РН, повинні бути заздалегідь звільнені від термолабильних ингибиторов. Для цього їх прогрівають при розведенні не менш ніж в два рази протягом 30 мін при 56 °С. Однако, антитіла до деяких вірусів (парагриппа, респираторно-синцитиальной інфекції) чутливі до прогрівання, тому при постановці РН з такими сироватками його потрібно уникати.

При зберіганні сироваток титр антитіл поступово знижується. Сироватки, що Довго зберігалися активізують додаванням до них 1/10 об'єму комплемента, що збільшує авидность антитіл. Вируснейтрализующие антитіла добре зберігаються в лиофильно висушеному або замороженому стані (-20 °З).

Для розведення вірусів при постановці РН на лабораторних тваринах або в курячих ембріонах використовують фосфатно-буферний розчин (рН 7,0... 7,2). При роботі з культурами кліток використовують ту середу, яку застосовують в якості підтримуючою для даного вигляду кліток (середа 199, 2,5...5%-ний гемогидролизат і інш.). Не треба застосовувати розчин звичайного изотонического хлорида натрію, оскільки в ньому швидко инактивируются багато які віруси.

У залежності від мети дослідження застосовують два варіанти постановки РН: 1 - для ідентифікації і визначення титру вируснейтрализующих антитіл в досліджуваних сироватках крові (в цьому випадку з'єднують рівні об'єми різних розведення сироватки з постійною дозою вірусу); 2 - для ідентифікації і вивчення невідомого вірусу (з'єднують рівні кількості одного і того ж розведення сироватки з убуваючими дозами вірусу). Результати реакції як в першому, так і у другому варіантах визначають про використанням лабораторних тварин, РКЕ і культур кліток.

Компонентами реакції в 1-м варіанті постановки РНявляются: досліджувана сироватка, стандартний вірусний антиген, тест-об'єкт, для контрольної реакції - діагностична і нормальна сироватки крові. Реакцію ставлять в два етапи: перший етап - визначення титру вірусу; другий - постановка основного досвіду РН в цьому варіанті.

Для определениятитра вирусаготовят 10-кратне розведення вируссодержащего матеріалу, звичайно з 10-1до 10-9, оскільки його титр рідко перевищує вказану величину. Беруть 9 стерильних пробірок і в кожну з них вносять по 4,5 мл фосфатно-буферних розчини. Потім в першу додають 0,5 мл вируссодержащего матеріали (розведення 1:10 або 10-1), суміш перемішують і 0,5 мл переносять у другу пробірку (розведення 1:100 або 10-2). З другої - 0,5 мл - в третя (10-3) і т. д., користуючись при цьому всякий раз чистою піпеткою. Кожним розведенням вируссодержащего матеріалу заражають лабораторних тварин (4 гол.). Об'єм матеріалу, що вводиться залежить від методу зараження, який зв'язують з тропизмом вірусу. Наприклад, при зараженні нейротропним вірусом досліджуваний матеріал вводять в мозок, пневмотропним - через ніс, дерматропним - на скарифицированную шкіру або внутрикожно і т. д. За тваринами спостерігають протягом 3...30 днів і більш, в залежності від віку і вигляду тварини і інш. чинників. Найбільше розведення вірусу, що забезпечує загибель половини (50%) заражених тварин, приймають за титр вірусу, що означається в цьому випадку символом ЛД50(летальна доза 50% використаних для зараження тварин). Допустимо, вірус в розведенні 104визвал загибель 50% тварин, це розведення і буде відповідати 1 ЛД5о. Отже, 100 ЛД50будет відповідати розведенню 102(1:100). Це розведення частіше за все використовують.

Аналогічно визначають титр вірусу на РКЕ по їх загибелі (ЕЛД50-ембріональна летальна доза) або по патологоанатомічних змінах (ЕИД50-ембрионинфицирующая доза) в культурі кліток по цитопатическому дії (1 ТЦД50- тканинна цитопатическая доза).

Постановка реакції. Після встановлення титру вірусу готують двократне розведення досліджуваної сироватки, починаючи з 1:2 до 1:128 і більш, в залежності від передбачуваного титру вируснейтрализующих антитіл, в об'ємі 0,5 мл і до кожного розведення сироватки додають по 0,5 мл вируссодержащего матеріали в розведенні, відповідному 100 ЛД5о- Одночасно ставлять контролі:

а) контроль вірусу (100 ЛД50віруссодержащего матеріали з'єднують з фізіологічним розчином в рівних об'ємах);

б) контроль імунної сироватки (імунну сироватку в робочому титрі з'єднують з вируссодержащим матеріалом в рівних об'ємах);

в) контроль нормальної сироватки (нормальну сироватку з'єднують з 100 ЛД5о вірусу в рівних об'ємах),

Пробірки струшують і витримують в термостаті при 37 °З протягом 30...60 мін. Сумішшю з кожної пробірки, в тому числі і з контрольних, заражають чутливих лабораторних тварин (4 гол.). Ідентифікацію вируснейтрализующих антитіл із застосуванням даного тестобъекта проводять при діагностиці ящура, сказу, лейкозу птахів. Об'єм і місце введення суміші ті ж, що були вибрані при визначенні 1 ЛД5о- Терміни спостереження за тваринами аналогічні вищепоказаним.

Облік результатів. Спочатку враховують результати контролів. У першому і третьому з них тварини повинні загинути, у другому- залишитися в живих. Якщо досліджувана сироватка містить антитіла, то вони будуть нейтралізувати патогенну дію вірусу і тварину не гине. Однак, сироватку використовують в розведенні, і, в зв'язку з цим, в певній пробірці антитіл виявиться недостатньо для нейтралізації вірусу. Відсоток загибелі тварин буде наростати в напрямі більшого розведення. Все це дає можливість визначити титр вируснейтрализующих антитіл, який розраховується по методах Ріда і Менча або Кербера. За титр антитіл досліджуваної сироватки приймають те розведення, яке запобігає загибелі 50% лабораторних тварин від дії 100 ЛД5о вірусу (табл. 10). При використанні РКЕ результат РН враховують по здатності вируснейтрализующих антитіл сироватки запобігати загибелі ембріонів, появі фокусів поразки на хорионаллантоисе і знижувати титр вірусних гемагглютининов у 50% курячих ембріонів. Ці методи застосовні при визначенні нейтралізуючої активності сироваток по відношенню до вірусів грипу, віспи, хвороби Ньюкасла, інфекційного ларинготрахеита і бронхіту курей.

Результат РН в культурі кліток оцінюють по здатності вируснейтрализующих антитіл досліджуваної сироватки в певному розведенні запобігати розвитку цитопатогенного ефекту (ЦПЕ), що використовується при діагностиці хвороби Ауєськи, ринопневмонії коней, вірусному гастроентерита свинь, хвороби Тешена, лейкозу птахів і інш. По гальмуванню феномена гемадсорбції до зараженим вірусом кліткам еритроцитів курки, людини, морської свинки діагностують грип і парагрипп.

Таблиця 10

Схема постановки реакції нейтралізації (визначення антитіл на білих мишах) Компоненти Номера лунка Контролі

вірусу Імунная сироватка Нор-ная сив-ка

Ф-Би розчин 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5

Досліджувана сироватка 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 в дез розчин 0,5 0,5

розведення, що Отримується 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256

Вірус в 100 ЛД 50 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 в дез розчин 0,5 0,5 0,5

Експозиція 20 мін при кімнатній температурі

Зараження мишей 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Експозиція 30...60 мін при кімнатній температурі. Вижило/ загинуло

Облік рез-ов 4/0 4/0 4/0 3/1 3/1 2/2 1/3 0/4 0/4 4/0 0/4

Титр антитіла = 1:64

Компонентами реакцииво 2-м варіанті постановки служать: досліджуваний вируссодержащий матеріал, діагностична (відома), нормальна (негативна) і досліджувана сироватки крові, тест-об'єкт. Цей варіант дозволяє ідентифікувати досліджуваний вірус і визначити індекс нейтралізації (ИН) специфічних і досліджуваних сироваток.

Дляпостановка РНготовят постійне розведення специфічної і нормальної сироваток (звичайно 1:10) і три ряди що 10-кратно убувають розведенні вірусу по 0,5 мл. Останнє розведення вірусу, взятого в досвід, повинно перевищувати його біологічний титр, оскільки в іншому випадку буде неможливо розрахувати індекс нейтралізації: наприклад, якщо титр вірусу 107ЕД5о > те в досвід потрібно брати вірус до розведення 10-8 В пробірки першого ряду додають специфічну сироватку (1:10) по 0,5 мл, у другий ряд - нормальну сироватку по 0,5 мл, в третій - фізіологічний розчин по 0,5 мл. Об'єм сироватки і вірусу повинен бути однаковим. Пробірки струшують і залишають на контакт. Тривалість цього періоду і температуру варіюють в залежності від вірусу, з яким проводиться робота. Після інкубації суміш сироватки з розведенням вірусу в об'ємі по 0,2 мл вводять в чутливу тест-систему, починаючи з розведення 10-8. Потім проводять облік реакції (табл. 11).

Таблиця 11.

Схема реакції нейтралізації для ідентифікації вірусу Компоненти Розведення вірусу Контроль сиворотток 1:10 Титр вірусу, lg Індекс нейтралізації, lg

10 -1 10 -2 10 -3 10 -4 10 -5 10 -6 10 -7 10 -8

Специфічна сироватка 1:10 + + - - - - - - -

+ + - - - - - - -

+_ - - - - - - - -

+ - - - - - - - -

Нормальна сироватка 1:10 + + + + + + + - - -

+ + + + + + + - -

+ + + + + + - - -

+ + + + + + - - -

Фізіологічний розчин + + + + + + + - - -

+ + + + + + + - -

+ + + + + + - - -

+ + + + + + - - -

Облік реакції. Якщо відбувається нейтралізація вірусу (немає змін в чутливому об'єкті), значить, антитіла діагностичної сироватки специфічні досліджуваному вірусу. Все це дає можливість визначити вигляд вірусу.

При обліку результатів РН по цьому варіанту користуються Е методом визначення індексу нейтралізації по Ріду і Менчу. Індекс нейтралізації являє собою відношення дози вірусу в суміші з нормальною сироваткою, зухвалою зміни у 50% чутливих об'єктів, до дози вірусу, зухвалої ті ж зміни в суміші з імунною сироваткою. Або, іншими словами, це число, що показує, у скільки разів специфічна сироватка знижує титр вірусу в порівнянні з нормальною. У нашому прикладі (табл. 11):

ИН = Т1/ Т2= 107/ 102= 105

гдеТ1- титр вірусу в присутності нормальної сироватки; Tg - титр вірусу в присутності специфічної сироватки.

Індекс нейтралізації до 10 вказує на відсутність вируснейтрализующих антитіл в сироватці, від 11 до 49 вважається сумнівним, а 50 і вище - позитивним.

У цей час існують різні модифікації проведення РН. Приведемо деякі з них.

Мікрометод РН. Застосовується при діагностиці везикулярного стоматита, грипу, парагриппа, аденовирусних інфекцій. При даному методі використовують пластмасові пластини, в лунка яких вирощують відповідну культуру кліток (ПЕС, ФЕК, СПЕВ, ТБ). Потім в лунка вносять двократне розведення випробуваної сироватки, сполучене з суспензією вірусу в концентрации100 ТКИД50 (тканинна інфікуюча доза) і через 4...7 діб інкубації оцінюють вираженість цитопатического дії вірусів. Даний метод дозволяє значно знизити витрати досліджуваних сироваток і вірусного діагностичного матеріалу, одночасно дослідити велику кількість зразків сироваток.

Кольорова проба. Суть цієї реакції полягає в здатності вірусу придушувати обмінні процеси в заражених клітках культури тканини. Клітинні суспензії з певною концентрацією кліток додають в пробірку або в лунка пластмасових пластин через годину після внесення в них суміші вірусу з певним розведенням сироватки. Кольорова проба заснована на тому, що клітки, розмножуючись в незаражених пробірках або пробірках зі сумішшю вірусу і його антитіл, що нейтралізували, утворять багато кислих продуктів обміну, які знижують рН живлячої середи. Це легко виявляють завдяки включеному до складу середи індикаторному барвнику (наприклад, феноловому червоному), колір якого міняється в залежності від рН середи. Червоний колір при рН 7,4.-7,8 стає оранжевим при рН 7,2, а при зниженні рН нижче за 7,0 - жовтим. При загибелі кліток під впливом вірусу не спостерігається виділення достатньої кількості кислих продуктів, тому середа залишається червоною. Титр вируснейтрализующих антитіл визначають як останнє розведення сироватки, яке в присутності доданого вірусу дозволило кліткам зберегти нормальні обмінні процеси, а отже, і знизити рН серед до того ж рівня, що і в незараженій контрольній культурі. Звичайно кольорову пробу широко використовують при роботі з ентеро- і аденовирусами тварин, а також вірусами птахів (хвороби Ньюкасла, інфекційний бурсита, інфекційний синовита сухожиль, хвороби Марека, інфекційного бронхіту птахів, герпеса индеек).

Метод супернейтрализації. Даний метод використовується для більш точного кількісного виявлення антитіл, що містяться в сироватках. Він заснований на повторному додаванні індикаторного вірусу, використаного при первинній постановці РН, до всіх проб сироваток, що нейтралізували вірус на першому етапі. У результаті знову виникає реакція взаємодії між вірусом і надлишковою кількістю антитіл. У пробах з більш низьким змістом антитіл ця нейтралізація не відбувається або буде частковою, внаслідок чого виявиться ЦПД вірусу на клітки. У пробах з лишком антитіл ЦПД буде знову бути відсутнім через повну нейтралізацію вірусу цими антитілами.

Анатомічні особливості хребта
Перша допомога, лікування і реабілітація
Травми м'язів (закриті)
Травми менісків колінного суглоба
СПОРТИВНІ ТРАВМИ
Синдром слабості синусового вузла
Астма й альвеолярний набряк легень

© 2018-2022  medmat.pp.ua